Течна хроматографија је главна метода за испитивање садржаја сваке компоненте и нечистоћа у сировинама, међупроизводима, препаратима и материјалима за паковање, али многе супстанце немају стандардне методе на које се могу ослонити, па је неизбежно развијати нове методе. У развоју метода течне фазе, хроматографска колона је језгро течне хроматографије, тако да је кључно како одабрати одговарајућу хроматографску колону. У овом чланку, аутор ће објаснити како одабрати колону за течну хроматографију са три аспекта: укупне идеје, разматрања и обим примене.
А.Укупне идеје за одабир колона за течну хроматографију
1. Процените физичка и хемијска својства аналита: као што су хемијска структура, растворљивост, стабилност (као што је да ли се лако оксидује/редукује/хидролизује), киселост и алкалност, итд., посебно хемијска структура је кључна фактор у одређивању особина, као што је коњугована група има јаку ултраљубичасту апсорпцију и јаку флуоресценцију;
2. Одредите сврху анализе: да ли је потребно високо одвајање, висока ефикасност колоне, кратко време анализе, висока осетљивост, отпорност на висок притисак, дуг животни век колоне, ниска цена итд.;
- Изаберите одговарајућу хроматографску колону: разумејте састав, физичка и хемијска својства хроматографског пунила, као што су величина честица, величина пора, температурна толеранција, пХ толеранција, адсорпција аналита, итд.
- Разматрања за избор колона за течну хроматографију
У овом поглављу ће се расправљати о факторима које треба узети у обзир при избору колоне за хроматографију из перспективе физичких и хемијских својстава саме хроматографске колоне. 2.1 Матрица за пуњење
2.1.1 Матрица силика гела Матрица за пуњење већине колона за течну хроматографију је силика гел. Овај тип пунила има високу чистоћу, ниску цену, високу механичку чврстоћу и лако се мењају групе (као што су фенилна веза, амино веза, цијано веза, итд.), али пХ вредност и температурни опсег који толерише су ограничени: пХ опсег већине пунила силика гела је 2 до 8, али пХ опсег специјално модификованих фаза везаних за силика гел може бити широк од 1,5 до 10, а постоје и посебно модификоване фазе везане за силика гел које су стабилне на ниском пХ, као што је Агилент ЗОРБАКС РРХД стаблебонд-Ц18, који је стабилан на пХ 1 до 8; горња температурна граница матрице силика гела је обично 60 ℃, а неке колоне за хроматографију могу толерисати температуру од 40 ℃ при високом пХ.
2.1.2 Полимерна матрица Полимерна пунила су углавном полистирен-дивинилбензен или полиметакрилат. Њихове предности су што могу толерисати широк пХ опсег – могу се користити у опсегу од 1 до 14, а отпорнији су на високе температуре (могу достићи и изнад 80 °Ц). У поређењу са Ц18 пунилима на бази силицијум-диоксида, ова врста пунила има јачу хидрофобност, а макропорозни полимер је веома ефикасан у одвајању узорака као што су протеини. Његови недостаци су што је ефикасност колоне нижа и механичка чврстоћа слабија од пунилаца на бази силицијум-диоксида. 2.2 Облик честице
Већина савремених ХПЛЦ пунила су сферне честице, али понекад су неправилне честице. Сферичне честице могу да обезбеде нижи притисак у колони, већу ефикасност колоне, стабилност и дужи век трајања; када се користе мобилне фазе високог вискозитета (као што је фосфорна киселина) или када је раствор узорка вискозан, неправилне честице имају већу специфичну површину, што је погодније за пуно деловање две фазе, а цена је релативно ниска. 2.3 Величина честица
Што је мања величина честица, већа је ефикасност колоне и већа је сепарација, али је отпорност на високи притисак лошија. Најчешће коришћена колона је колона величине честица од 5 μм; ако је захтев за одвајањем висок, може се изабрати пунило од 1,5-3 μм, што је погодно за решавање проблема сепарације неких сложених матричних и вишекомпонентних узорака. УПЛЦ може користити пунила од 1,5 μм; За полупрепаративне или препаративне колоне често се користе пуниоци величине честица величине 10 μм или веће. 2.4 Садржај угљеника
Садржај угљеника се односи на пропорцију везане фазе на површини силика гела, која је повезана са специфичном површином и покривеношћу везаном фазом. Висок садржај угљеника обезбеђује висок капацитет колоне и високу резолуцију, и често се користи за сложене узорке који захтевају високо одвајање, али због дугог времена интеракције између две фазе, време анализе је дуго; хроматографске колоне са ниским садржајем угљеника имају краће време анализе и могу показати различиту селективност и често се користе за једноставне узорке који захтевају брзу анализу и узорке који захтевају услове високе водене фазе. Генерално, садржај угљеника Ц18 креће се од 7% до 19%. 2.5 Величина пора и специфична површина
ХПЛЦ адсорпциони медијуми су порозне честице и већина интеракција се одвија у порама. Због тога молекули морају ући у поре да би се адсорбовали и одвојили.
Величина пора и специфична површина су два комплементарна концепта. Мала величина пора значи велику специфичну површину, и обрнуто. Велика специфична површина може повећати интеракцију између молекула узорка и везаних фаза, побољшати задржавање, повећати оптерећење узорка и капацитет колоне, и одвајање сложених компоненти. Потпуно порозна пунила спадају у ову врсту пунила. За оне са високим захтевима за одвајање, препоручује се одабир пунила са великом специфичном површином; мала специфична површина може смањити противпритисак, побољшати ефикасност колоне и смањити време равнотеже, што је погодно за анализу градијента. Језгро-љуска пунила припадају овој врсти пунила. Полазећи од претпоставке да се обезбеди раздвајање, препоручује се одабир пунила са малом специфичном површином за оне са високим захтевима за ефикасност анализе. 2.6 Запремина пора и механичка чврстоћа
Запремина пора, такође позната као "запремина пора", односи се на величину запремине празнине по јединици честице. Може добро да одражава механичку чврстоћу пунила. Механичка чврстоћа пунила са великом запремином пора је нешто слабија од пунила са малом запремином пора. За ХПЛЦ одвајање се углавном користе пуниоци са запремином пора мањим или једнаким 1,5 мЛ/г, док се пуниоци са запремином пора већим од 1,5 мЛ/г углавном користе за молекуларну ексклузијску хроматографију и хроматографију ниског притиска. 2.7 Стопа ограничења
Затварање може смањити врхове заосталог репа узроковане интеракцијом између једињења и изложених силанолних група (као што је јонска веза између алкалних једињења и силанолних група, ван дер Валсове силе и водоничне везе између киселих једињења и силанолних група), чиме се побољшава ефикасност колоне и облик врха . Незатворене везане фазе ће произвести различите селективности у односу на затворене везане фазе, посебно за поларне узорке.
- Обим примене различитих колона за течну хроматографију
Ово поглавље ће описати обим примене различитих типова колона за течну хроматографију кроз неке случајеве.
3.1 Реверзна фаза Ц18 хроматографске колоне
Колона Ц18 је најчешће коришћена колона обрнуте фазе, која може да испуни тестове садржаја и нечистоћа већине органских супстанци, а применљива је на средње поларне, слабо поларне и неполарне супстанце. Тип и спецификација Ц18 хроматографске колоне треба изабрати у складу са специфичним захтевима за одвајање. На пример, за супстанце са високим захтевима за одвајање, често се користе спецификације од 5 μм*4,6 мм*250 мм; за супстанце са сложеним матрицама за раздвајање и сличним поларитетом, могу се користити спецификације 4 μм*4,6 мм*250 мм или мање величине честица. На пример, аутор је користио колону од 3 μм*4,6 мм*250 мм за детекцију две генотоксичне нечистоће у АПИ целекоксиба. Раздвајање две супстанце може да достигне 2,9, што је одлично. Поред тога, под претпоставком да се обезбеди раздвајање, ако је потребна брза анализа, често се бира кратка колона од 10 мм или 15 мм. На пример, када је аутор користио ЛЦ-МС/МС за детекцију генотоксичне нечистоће у пиперахин фосфату АПИ, коришћена је колона од 3 μм*2,1 мм*100 мм. Раздвајање између нечистоће и главне компоненте било је 2,0, а детекција узорка се може завршити за 5 минута. 3.2 Фенил колона обрнуте фазе
Фенил колона је такође врста колоне обрнуте фазе. Ова врста колоне има јаку селективност за ароматична једињења. Ако је одзив ароматичних једињења мерених обичном Ц18 колоном слаб, можете размислити о замени фенил колоне. На пример, када сам правио АПИ за целекоксиб, одговор главне компоненте измерен помоћу фенил колоне истог произвођача и исте спецификације (свих 5 μм*4,6 мм*250 мм) био је око 7 пута већи од Ц18 колоне. 3.3 Колона нормалне фазе
Као ефикасан додатак колони обрнуте фазе, колона нормалне фазе је погодна за високо поларна једињења. Ако је врх и даље веома брз када се елуира са више од 90% водене фазе у колони обрнуте фазе, па чак и близу и преклапа се са врхом растварача, можете размислити о замени колоне нормалне фазе. Овај тип колоне укључује хилиц колону, амино колону, цијано колону итд.
3.3.1 Хилиц колона Хилиц колона обично уграђује хидрофилне групе у везани алкил ланац да би се побољшао одговор на поларне супстанце. Ова врста колоне је погодна за анализу шећерних супстанци. Аутор је ову врсту колоне користио када је радио садржај и сродне супстанце ксилозе и њених деривата. Изомери деривата ксилозе такође могу бити добро раздвојени;
3.3.2 Амино колона и цијано колона Амино колона и цијано колона се односе на увођење амино и цијано модификација на крају везаног алкил ланца, респективно, ради побољшања селективности за посебне супстанце: на пример, амино колона је добар избор за одвајање шећера, аминокиселина, база и амида; цијано колона има бољу селективност при раздвајању хидрогенизованих и нехидрогенисаних структурно сличних супстанци због присуства коњугованих веза. Амино колона и цијано колона се често могу пребацивати између колоне нормалне фазе и колоне обрнуте фазе, али се често мењање не препоручује. 3.4 Хирална колона
Хирална колона, као што само име каже, погодна је за одвајање и анализу хиралних једињења, посебно у области фармацеутских производа. Овај тип колоне се може узети у обзир када конвенционалне колоне са реверзном фазом и колоне нормалне фазе не могу да постигну раздвајање изомера. На пример, аутор је користио хиралну колону од 5 μм*4,6 мм*250 мм да раздвоји два изомера 1,2-дифенилетилендиамина: (1С, 2С)-1, 2-дифенилетилендиамин и (1Р, 2Р)-1,2 -дифенилетилендиамин, а раздвајање између њих је достигло око 2,0. Међутим, хиралне колоне су скупље од других типова колона, обично 1В+/комад. Ако постоји потреба за таквим колонама, јединица треба да направи довољан буџет. 3.5 Колона јонске измене
Колоне за јонску размену су погодне за одвајање и анализу наелектрисаних јона, као што су јони, протеини, нуклеинске киселине и неке супстанце шећера. Према типу пунила, деле се на колоне за катјоне, колоне за ањонску измјену и јаке катјонске измјењивачке колоне.
Колоне за катјонску измену укључују колоне на бази калцијума и водоника, које су углавном погодне за анализу катјонских супстанци као што су аминокиселине. На пример, аутор је користио колоне на бази калцијума када је анализирао калцијум глуконат и калцијум ацетат у раствору за испирање. Обе супстанце су имале јаке реакције на λ=210нм, а степен раздвајања је достигао 3,0; аутор је користио колоне на бази водоника када је анализирао супстанце које су повезане са глукозом. Неколико главних сродних супстанци – малтоза, малтотриоза и фруктоза – имале су високу осетљивост под диференцијалним детекторима, са границом детекције од чак 0,5 ппм и степеном раздвајања од 2,0-2,5.
Колоне за ањонску измјену су углавном погодне за анализу ањонских супстанци као што су органске киселине и халоген јони; јаке катјонске измењиве колоне имају већи капацитет измене јона и селективност и погодне су за одвајање и анализу сложених узорака.
Горе наведено је само увод у типове и опсеге примене неколико уобичајених колона за течну хроматографију у комбинацији са сопственим искуством аутора. Постоје и други посебни типови хроматографских колона у стварним применама, као што су хроматографске колоне са великим порама, хроматографске колоне са малим порама, колоне за афинитетну хроматографију, мултимодне хроматографске колоне, колоне за течну хроматографију ултра високих перформанси (УХПЛЦ), колоне за суперкритичну флуидну хроматографију ( СФЦ) итд. Они играју важну улогу у различитим областима. Специфичан тип хроматографске колоне треба изабрати према структури и својствима узорка, захтевима за одвајање и другим наменама.
Време поста: 14.06.2024