Принципи и методе квантитативне анализе течном хроматографијом

Механизам раздвајања течне хроматографије заснива се на разлици у афинитету компоненти у смеши за две фазе.

Према различитим стационарним фазама, течна хроматографија се дели на течно-чврсту хроматографију, течно-течну хроматографију и хроматографију везане фазе.Најшире коришћене су течно-чврста хроматографија са силика гелом као пунилом и хроматографија везане фазе са микросилицијум диоксидом као матриксом.

Према облику стационарне фазе, течна хроматографија се може поделити на хроматографију на колони, папирну хроматографију и танкослојну хроматографију.Према капацитету адсорпције, може се поделити на адсорпциону хроматографију, партициону хроматографију, хроматографију за измене јона и хроматографију са гел пермеацијом.

Последњих година, систем протока течности под високим притиском додат је систему хроматографије течне колоне како би се мобилна фаза брзо протицала под високим притиском како би се побољшао ефекат сепарације, тако да је течна хроматографија високе ефикасности (такође позната као под високим притиском) појавио.

ПАРТ
01 Принцип квантитативне анализе течне хроматографије

За квантификацију на основу квалитативних, потребне су чисте супстанце као стандарди;

Квантификација течном хроматографијом је релативно квантитативна метода: то јест, количина аналита у смеши се процењује из познате количине чистог стандардног узорка

ПАРТ
02 Основа за квантификацију течном хроматографијом

Количина измерене компоненте (В) је пропорционална вредности одговора (А) (висина врха или површина врха), В=ф×А.

Квантитативни фактор корекције (ф): То је константа пропорционалности формуле квантитативног израчунавања, а њено физичко значење је количина мерене компоненте представљена јединичном вредношћу одзива (површина пика).

Квантитативни фактор корекције може се добити из познате количине стандардног узорка и његове вредности одговора.

Измерите вредност одговора непознате компоненте, а количина компоненте се може добити помоћу квантитативног фактора корекције.

ПАРТ
03 Уобичајени појмови у квантитативној анализи

Узорак (узорак): раствор који садржи аналит за хроматографску анализу.Подијељен на стандардне и непознате узорке.

Стандард: Чист производ са познатом концентрацијом.Непознати узорак (непознато): Смеша чија концентрација треба да се испита.

Тежина узорка: Оригинално вагање узорка који се тестира.

Разблаживање: Фактор разблажења непознатог узорка.

Компонента: хроматографски пик који треба квантитативно анализирати, односно аналит чији је садржај непознат.

Количина компоненте (количина): садржај (или концентрација) супстанце која се испитује.

Интегерити : Рачунски процес мерења површине пика хроматографског пика помоћу рачунара.

Калибрациона крива: Линеарна крива садржаја компоненте у односу на вредност одговора, утврђена из познате количине стандардне супстанце, која се користи за одређивање непознатог садржаја аналита.

ПАРТ
04 Квантитативна анализа течне хроматографије

1. Изаберите хроматографску методу погодну за квантитативну анализу:

л Потврдите врх откривене компоненте и постигните резолуцију (Р) већу од 1,5

л Одредити конзистенцију (чистоћу) хроматографских пикова испитиваних компоненти

л Одредити границу детекције и границу квантификације методе;осетљивост и линеарни опсег

2. Успоставити калибрациону криву са стандардним узорцима различитих концентрација

3. Проверите тачност и прецизност квантитативних метода

4. Користите одговарајући софтвер за управљање хроматографијом за спровођење прикупљања узорака, обраде података и извештавања о резултатима

ПАРТ
05 Идентификација квантитативних пикова (квалитативних)

Квалитативно идентификујте сваки хроматографски пик који треба квантификовати

Прво, користите стандардни узорак да одредите време задржавања (Рт) хроматографског пика који треба квантификовати.Упоређивањем времена задржавања, пронађите компоненту која одговара сваком хроматографском пику у непознатом узорку.Квалитативна хроматографска метода је упоређивање времена задржавања са стандардним узорком.Критеријум недовољандаља потврда (квалитативно)

1. Стандардна метода сабирања

2. Користите друге методе истовремено: друге хроматографске методе (промените механизам, као што је: коришћење различитих хроматографских колона), друге детекторе (ПДА: поређење спектра, претрага библиотеке спектра; МС: анализа масеног спектра, претрага библиотеке спектра)

3. Други инструменти и методе

ПАРТ
06 Потврда квантитативне конзистенције пика

Потврдите конзистенцију хроматографског врха (чистоће)

Уверите се да постоји само једна мерена компонента испод сваког хроматографског пика

Проверите да ли има сметњи од коелуираних супстанци (нечистоће)

Методе за потврду конзистенције хроматографског врха (чистоће)

Поређење спектрограма са фотодиодним матричним (ПДА) детекторима

Идентификација врхунске чистоће

2996 Теорија угла чистоће

Квантитативне методе које се обично користе у ДЕЛУ 07

Метода стандардне криве, подељена на метод екстерног стандарда и метод интерног стандарда:

1. Метода екстерног стандарда: најчешће се користи у течној хроматографији

Серија стандардних узорака познатих концентрација је припремљена коришћењем чистих узорака једињења која се тестирају као стандардни узорци.убризгана у колону до њене вредности одговора (вршна површина).
У оквиру одређеног опсега постоји добра линеарна веза између концентрације стандардног узорка и вредности одговора, односно В= ф×А , и направљена је стандардна крива.

Под потпуно истим експерименталним условима, убризгајте непознати узорак да бисте добили вредност одговора компоненте која се мери.Према познатом коефицијенту ф може се добити концентрација компоненте која се мери.

Предности методе екстерног стандарда:једноставан рад и прорачун, то је уобичајена квантитативна метода;нема потребе да се свака компонента детектује и елуира;потребан је стандардни узорак;услови мерења стандардног узорка и непознатог узорка треба да буду конзистентни;запремина ињекције треба да буде прецизна.

Недостаци методе екстерног стандарда:Захтева се да експериментални услови буду високи, као што су осетљивост детектора, брзина протока и састав мобилне фазе не могу се мењати;запремина сваке ињекције треба да има добру поновљивост.

2. Метода интерног стандарда: тачан, али проблематичан, најчешће се користи у стандардним методама

Позната количина интерног стандарда се додаје стандарду да се добије мешани стандард и припрема се серија радних стандарда познате концентрације.Моларни однос стандарда према интерном стандарду у мешовитом стандарду остаје непромењен.Убризгајте у хроматографску колону и узмите (површина пика стандардног узорка/површина унутрашњег стандардног узорка) као вредност одговора.Према линеарном односу између вредности одзива и концентрације радног стандарда, односно В= ф×А , направљена је стандардна крива.

Позната количина интерног стандарда се додаје непознатом узорку и убризгава у колону да би се добила вредност одговора компоненте која се мери.Према познатом коефицијенту ф може се добити концентрација компоненте која се мери.

Карактеристике методе интерног стандарда:Током операције, узорак и интерни стандард се мешају заједно и убризгавају у хроматографску колону, тако да све док је однос количине мерене компоненте према интерном стандарду у мешаном раствору константан, промена запремине узорка неће утицати на квантитативне резултате..Метода интерног стандарда надокнађује утицај запремине узорка, па чак и мобилне фазе и детектора, тако да је тачнија од методе екстерног стандарда.

ПАРТ
08 Фактори који утичу на резултате квантитативне анализе

Лоша прецизност може бити узрокована:

Нетачна интеграција површине врха, распадање узорка или нечистоће унесене током припреме узорка, бочица са узорком није затворена, испаравање узорка или растварача, нетачна припрема узорка, проблеми са убризгавањем узорка, нетачна припрема интерног стандарда

Могући разлози за лошу прецизност:

Нетачна интеграција врха, проблеми убризгавања или ињектора, распадање узорка или нечистоће унесене током припреме узорка, хроматографски проблеми, деградирани одговор детектора